普通PCR技术的实验方法

克隆构建表达质粒通常包含四个基本步骤:

①  分别获得目标DNA和载体DNA

②  使用限制性内切酶对目标和载体DNA进行切割,产生可以相互连接的末端

③  通过切割末端连接目标和载体DNA

④  最后使用连接产物转化细菌等宿主细胞。

PCR技术在目标DNA的大量扩增和准确获得过程中扮演着重要的角色,直接决定后续克隆工作的成败。该部分实验中,将以克隆构建表达具有多个剪接体的RNA结合蛋白( RNA binding protein with multiplesplices, RBPMS)基因的质粒为例,说明如何利用PCR技术从cDNA文库中获得目的片段,并为后续克隆构建工作作准备

 1.实验设计思路和基本步骤

  (1)调取基因

    ①在NCBI网站左栏选择“Gene”,右侧输入关键词“RBPMS”,获得有关 RBPMS基因的众多序列,选择合适的物种( Homo sapiens,人; Rattus norvegicus,大鼠;Mus,小鼠等)对应的序列

    ②获得关于该基因的所有序列,包括mRNA全序列、基因组序列和氨基酸序列等,选择mRNA序列。

    ③看编码序列(CDS)对应的核苷酸区域,即为RBPMS克隆构建所需的序列(666-1256),起始核苷酸编码一定为ATG,最后三位为终止密码子

  (2)设计引物

    根据 RBPMS基因的CDS序列为模板,设计引物。用作克隆目的的PCR,因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低,但是在此基础上,仍然要尽量遵循下列原则,以获得比较满意的实验结果

    引物设计有3条基本原则:引物与模板的序列要紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配),从而获得非特异性产物

    具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素,如引物长度、产物长度、序列Tm值引物之间或引物与模板非特异性区域之间形成二级结构、在错配位点的引发效率、引物及产物的G+C含量,等等。具体如下

①  物长度。15~30bp,常用为20bp左右。引物长度通常为20~25 mer。但进行长片段LA PCR( Long and Accurate PCR)时,引物长度应增长为30~35mer。扩增G+C rich模板时,引物设计在30mer以上

②  物碱基。G+C含量以40%~60%为宜,G+C太少,扩增效果不佳,G+C过多,易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，上下游引物的G+C含量不能相差太大,引物为20mer以下时

   Tm=2℃×(A+T)+4℃×(G+C);引物为20mer以上时:Tm=81.5+0.41×(G+C)-600/L,其中L为引物的长度

    ③避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

    ④引物3′端的碱基,避免出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,会使错误引发概率增加,此外,引物3′端碱基不能与靶序列中间部位发生3个碱基以上的互补,否则容易导致错配,结果是特异性产物减少,非特异性产物增多

    ⑤引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为AT的错配效率明显高于其他3个碱基,因此,应当避免在引物的3′端使用碱基AT

    ⑥选择酶切效率较高的酶切位点,并且该酶切位点不包含在目的靶序列中,在固定序列的5端增加酶切位点和保护碱基。将引物核酸序列与数据库的其他序列比对,确保无明显的同源性。

⑦扩增文库时往往涉及简并引物,简并性引物对PCR扩增有一定的影响,通常一条引物中简并的碱基不要超过4处,如果简并的碱基数过多,则会造成反应体系中有效引物量的相对减少,此时应适当增加引物的使用量。但引物量过大,容易引起非特异扩增，应加以注意。

   （3）优化PCR体系

   PCR体系反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种,即引物、酶、dNTP、模板  和Mg

①  模板。一般来讲,50ul PCR反应体系中模板DNA推荐使用量:人基因组DNA，0.1~1ul;大肠杆菌基因组DNA，10~100ng;质粒DNA，0.1~10ng。对高G+C含量的目的片段进行扩增时,在反应液中按1%-5%(体积分数)加入DMSO（二甲基亚砜)则可改善扩增结果。

②  引物的纯度和引物量。一般级别的克隆PCR,对引物纯度没有严格要求。对10kb以上的目的片段进行PCR时,引物的纯化级别高,则可得到良好的扩增。因此,进行Long    PCR时,推荐使用Cartridge纯化级别以上的引物,而非脱盐纯化级别。每条引物的浓度为0.1~1μmol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会

③   酶的选择及其浓度。现有市售PCR试剂盒可选择的种类非常多,根据实验性质和目的选择适合的PCR试剂,通常可以获得满意的结果。各种酶根据可信度、扩增的DNA长度的能力,以及扩增量等性质来进行选择。如在进行PCR克隆、cDNA文库扩增、变异引人等需要高保真的实验中,需要选择错配率低的高保真酶来完成;需要获得的目的片段较长,如超过10kbp时,需要选择针对长片段扩增的酶进行反应;需要通过PCR对食品、环境卫生检验时,需要获得一定的扩增量,因此,也需要选择特殊的酶,如 TAKARA公司的LA PCR( Long and Accurate PCR)技术,运用此技术可大量正确地扩增长达40kbp的DNA片段。

    ④Mg2+浓度和dNTP浓度。通常根据酶的性质和需要配备在mix中,实验者一般不需要额外调整。如 TAKARA公司对于PCR扩增有十几种酶,对于其性质和要求均有明确的标识，实验者可以根据自己的实验目的和需要进行选择。

   4)优化PCR程序

Hot Start PCR(热启动PCR)是提高PCR特异性的最重要方法之一。这种反应可以防止在PCR反应第一步骤因引物的错配或引物二聚体的形成而导致的非特异性扩增，从而提高目的DNA片段的扩增效率。因此,反应程序通常有热启动这一步骤,之后是循环扩增的变性一退火一延伸阶段,之后是充分的延伸时间,以确保可以进行后续PCR产物分析。

根据PCR试剂的推荐,现在PCR反应程序可以分为两步法(退火和延伸合并为一个温度)和三步法,两者相比并无明显的优劣,可以根据具体实验进行摸索和选择,尤其是使用Tm值较高的引物(>72℃)进行PCR,出现杂带时,可尝试采用98~68℃的两步法PCR。此外,扩增长片段PCR时,关键之一是设计30mer以上的长引物,以增加引物的特异性。而长引物的Tm值一般较高,退火温度和延伸温度间的差距较小,当退火温度超过60℃时，两者就可以设定在同一数值,此时进行两步法PCR反应,效果较佳(见图3-2,每个阶段的时间根据目的片段的长度和选择的试剂盒要求的不同而异)。

    此外,实验者可以主要优化退火温度、延伸时间和循环次数三个因素。在PCR反应过中选择退火温度时,一般为(Tm-5)℃起始设置梯度进行优化。延伸时间根据选择的试酶的延伸能力(每分钟的碱基数)和扩增目的片段的长度进行设定,保证有充分的延伸。延伸时间过短,目的DNA序列不能获得完全延伸,导致假阴性结果。循环数也不易过多,过多的循环数会引起非特异扩增和突变,一般以25~30个循环为佳,最多时间不超过35个循环。

   (5)结果检测与分析

    ①琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。PCR扩增反应完成之后,需要经过鉴定确定是否获得目的扩增产物的定性分析和半定量分析。凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法,能判断产物的大小,有助于产物的鉴定。凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳(1%~2%)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(6%~10%),前者主要用于DNA片段大于100bp者后者主要用来检测小片段DNA。

    ②测序分析。PCR产物电泳后,为了保证产物是真正的目的片段而非假阳性,必须割胶后回收进行测序,测序结果正确是判断克隆成功的金标准。

 

图3-2  PCR(三步法)步骤

步骤1:在含有引物、dNTP及DNA聚合酶的反应液中双链DNA热变性;

步骤2:引物与热变性生成的单链DNA退火;

步骤3:在DNA聚合酶作用下合成互补链;

步骤4:扩增的双链DNA再次热变性,生成单链DNA;

步骤1~4称为一个循环,如此循环往复25~30次。